專門用來檢測地表水，在不同倍數的稀釋后進行培養檢測，準確掌握水樣稀釋倍數對測定結果就越準確。

酶底物法（ enzyme substrate technique）的原理是：利用大腸菌群細菌能產生β2半乳糖苷酶（β2D2galactosidase）分解ON 2PG（O rtho2 nitrophenyl2β2D2galactopyranoside ）使培養液呈黃色 ,檢測水樣中是否含有大腸菌群。利用大腸埃希菌產生β2葡萄、糖、醛、酸、酶、（ β2glucuronidase ）分解MUG（ 42 methyl2umbelliferyl2β2D2glucuronide）使培養液在波長366 nm紫外光下產生藍色熒光 , 檢測水樣中是否含有大腸埃希菌。酶底物法有商品化試劑供應 ,實驗操作簡便 ,無需確認試驗 ,可同時檢測水樣中大腸菌群和大腸埃希菌。如果改變培養溫度，還可檢測耐熱大腸菌群。該方法檢測周期短 , 18 ～24 h 即可報告結果。可見該方法的特點是節省了時間和人力。

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